Proteómica

Identificación de proteínas por espectrometría de masas

• Identificación de proteínas provenientes de geles SDS-PAGE por espectrometría de masas LC-ESI-MS/MS
• Identificación de proteínas en muestras complejas por espectrometría de masas de alta resolución y movilidad iónica

Cuantificación relativa de proteínas sin marcaje (label free) por espectrometría de masas de alta resolución y movilidad iónica

Cuantificación dirigida de proteínas por LC-ESI-MS/MS (técnica SRM) 

Cuantificación dirigida de metabolitos por HPLC-MS/MS (técnica SRM):

• Esteroles en suero
• 7-ketocolesterol en plasma
• Glucosilesfingosina (LysoGB1) en plasma

Separación de proteínas mediante técnicas de electroforesis

Precipitación de proteínas

Extracción de proteínas (compatible con espectrometría de masas)

Extracción de metabolitos y lípidos en plasma/suero

Depleción de HSA e IgG en suero/plasma humano

Cambio de buffer

Cuantificación de proteína total por ensayo colorimétrico

Posibilidad de realizar el servicio como autousuario, siempre que se demuestre experiencia en estas técnicas:

• Separación de proteínas mediante electroforesis SDS-PAGE (1D)
• Escaneado de Western Blot por infrarrojos (Odyssey CLx)

Expresión diferencial de proteínas

Uno de los aspectos claves en investigación biomédica es poder identificar y cuantificar las variaciones a nivel de expresión de proteínas entre individuos sanos y enfermos, y a su vez los cambios observados durante los diferentes estadios de la patología con el fin de descubrir biomarcadores de pronóstico o diagnóstico.

Para este tipo de estudios recomendamos la técnica de cuantificación relativa de proteínas sin marcaje (label free) por espectrometría de masas de alta resolución.

En esta técnica las proteínas de cada muestra se digieren con la enzima tripsina. Los péptidos resultantes se analizan por cromatografía líquida (LC) acoplada a espectrometría de masas de alta resolución. La identificación de las proteínas se realiza mediante los espectros de MS/MS y la cuantificación relativa se realiza según la intensidad de los péptidos en el espectro de MS. Variaciones en dichas intensidades se traducen en una variación en los niveles de la proteína que dio lugar a dicho péptido.

Cuantificación dirigida de proteínas

La validación de los potenciales biomarcadores descubiertos en la fase anterior de expresión diferencial es uno de los principales retos de la investigación biomédica. Para ello es necesario disponer de herramientas que permitan la cuantificación de manera precisa de aquellas proteínas de interés en diferentes muestras biológicas.

El servicio de Proteómica ofrece la técnica Selected Reaction Monitoring (SRM). En esta técnica, la cuantificación se realiza a nivel de péptido por lo que primero las proteínas de cada muestra serán digeridas con la enzima tripsina. Posteriormente los péptidos se separan en un equipo de LC y se introducen secuencialmente en el espectrómetro de masas 6500QTRAP+. Desde un punto de vista instrumental, en un análisis SRM típico el primer cuadrupolo Q1 transmite a Q2 una sola masa (m1), correspondiente al péptido tríptico completo. En Q2 se fragmenta ese péptido en fragmentos más pequeños (m2, m3, m4, etc). El tercer cuadrupolo Q3 opera de forma que sólo transmite algunos de dichos fragmentos (por ejemplo, m2, m3). Esas transiciones (m1 a m2 y m1 a m3), generan unos picos cromatográficos que, en función de su intensidad relativa, podrán cuantificar cambios a nivel de abundancia proteica. Para cuantificar puede ser necesario la compra de péptidos sintéticos marcados isotópicamente.

Podemos destacar como principales aplicaciones de la técnica de SRM:

• Validación de los biomarcadores
• Cuantificación de proteínas sin necesidad de anticuerpo
• Cuantificación de proteínas con modificaciones postraduccionales
• Cuantificación de proteínas mutadas

Cuantificación de metabolitos conocidos

La cuantificación de metabolitos es igualmente interesante en la búsqueda de biomarcadores de pronóstico o diagnóstico en biomedicina. En este caso la molécula diana no será una proteína sino una molécula pequeña.

En el Servicio de Proteómica ofrecemos la posibilidad de desarrollar y validar métodos analíticos para la cuantificación de determinados metabolitos. Posteriormente, usaremos esos métodos analíticos para cuantificar aquellos metabolitos en muestras de interés. Para ello utilizaremos la técnica de SRM explicada anteriormente y el espectrómetro de masas 6500QTRAP+ acoplado a un HPLC analítico. Para poder realizar la cuantificación será necesario la compra de los estándares de las moléculas de interés, así como sus estándares internos (normalmente la misma molécula marcada isotópicamente).

• Espectrómetro de masas de alta resolución y movilidad iónica TIMS TOF FLEX (Bruker), cromatógrafo Evosep One (Evosep)
• Espectrómetro de masas 6500QTRAP+ (Sciex), HPLC nano/micro LC425 (Sciex) y UPLC Acquity H-class (Waters)
• Software: PASER (Bruker), Scils Lab Pro (Bruker), Mascot Daemon (MatrixScience), Multiquant (Sciex), Skyline (UW)

• Enfoque isoeléctrico: Protean IEF (Bio-Rad) (7,18 y 25 cm)
• SDS-PAGE: Protean plus dodeca (Bio-Rad), Mini-protean plus dodeca (Bio-Rad) y mini-protean (Bio-Rad)
• Escaneado Western Blot: Odyssey CLx (Li-cor)
• Digestor automático de proteínas MSI Complete (Intavis)

• Identificación de biomarcadores diagnósticos derivados de células sanguíneas en cáncer colorrectal. FIS PI23/00447
• Herramientas multifuncionales basadas en metales para diversas aplicaciones (MultiMetTools). PID2022-136861NB-I00
• Investigación de la interacción del SARS-CoV-2 y el huésped a nivel proteómico. PIE COVID 202020E108
• Las plaquetas como biormarcadores en cáncer colorrectal: estudio del transcriptoma, proteoma y marcadores de activación plaquetaria. FIS PI17-02171
• Proyecto Spanish Human Proteome Project Chr 16 Consortium (SpHPP). Iniciativa englobada en el Human Proteome Project (HPP) y en la Plataforma de Recursos Biomoleculares. Programa de Proteómica (ISCIII AES-2017-PRB3)

• Innovative biomaterial for 3D skin models: Unraveling protein composition through varied extraction methods and mass spectrometric Analysis of human decellularized dermis-derived extracellular matrix scaffold. Fernandez-Carro E., Remacha AR., Orera I., Lattanzio G., Garcia-Barrios A., del Barrio J., Alcaine C., Ciriza J. IX Congress of the Spanish Proteomics Society, 6-9 febrero 2024, Córdoba.
• Mapping the serum proteome of COVID-19 patients in a Spain population. A guidance for severity assessment. Nuñez E., Orera I., Carmona-Rodríguez L., Paño JR., Vázquez J., Corrales FJ. Biomedicines. 2022 Jul 13;10(7):1690. doi:10.3390/biomedicines10071690
• Mapping the serum proteome of COVID-19 patients in a Spain population. A guidance for severity assessment. Nuñez E., Orera I., Carmona-Rodríguez L., Paño JR., Vázquez J., Corrales FJ. https://eventos.corp.csic.es/event/73/. Congreso PTI + Salud Global 2022. 5-6 octubre 2022, Valencia.
• Component release after exposure of Staphylococcus aureus cells to pulsed electric fields. Freire V., Lattanzio G., Orera I., Mañas P., Cebrián G. Innovative Food Science and Emerging Technologies 74, (2021)  https://doi.org/10.1016/j.ifset.2021.102838
• Altered plant and nodule development and protein Snitrosylation in Lotus japonicus mutants deficient in S nitrosoglutathione reductases. Matamoros M. A., Cutrona M. C., Wienkoop S., Begara-Morales J. C., Sandal N., Orera I., Barroso J. B., Stougaard J., Becana M. Plant & Cell Physiology (2020) 61(1): 105–117
• Unraveling the composition of insecticidal crystal proteins in Bacillus thuringiensis: a proteomics approach. Caballero J, Jiménez-Moreno N, Orera I, Williams T, Fernández A B, Villanueva M, Ferré J, Caballero P, Ancín-Azpilicueta C. Applied and Environmental Microbiology (2020)  86(12) DOI: 10.1128/AEM.00476-20
• Caracterización de los cambios en el proteoma plaquetario asociados al desarrollo de cáncer colorrectal Piazuelo E., Sopeña F., Arechavaleta S., Orera I., Cebollada A., Roncalés P., Hernáez M.L., Lattanzio G., Vadillo P., Chueca E., García-González M.A., Lanas Á. 23º Reunión anual Asociación Española de Gastroenterología. 4-5 noviembre, 2020