Secuenciación y Genómica Funcional

Esta técnica ha demostrado ser una excelente herramienta para la identificación y cuantificación de ácidos nucleicos. Entre las numerosas aplicaciones desarrolladas figuran los estudios de cuantificación absoluta o relativa de perfiles transcripcionales, medida de número de copias de un gen en DNAs genómicos o virales, estudios de discriminación alélica (SNPs), ensayos de detección e identificación de patógenos y de OMGs, etc.

Las estrategias de marcaje utilizadas se basan en sondas Taqman o SYBR Green. La detección de la fluorescencia en el equipo ABI PRISM 7000 se realiza mediante filtros de emisión optimizados para el uso de los fluoróforos FAM™/SYBR® Green 1, VIC™/JOE, NED™/TAMRA™ y ROX™.

El sistema de calentamiento, basado en “Peltier”, es compatible con placas estandard de 96 pocillos o con tubos eppendorf de 0,2 ml.

El diseño de los cebadores y sondas está asistido mediante el software Primer Express v2.0(Applied Biosystems), y el diseño del experimento y tratamiento de los resultados obtenidos mediante el software Sequence Detection Software v1.2.3(Applied Biosystems), ambos a disposición de los usuarios del Servicio.

• Autosecuenciación y autosecuenciación sin material de carga
  • Se entregan las reacciones de secuenciación ya preparadas para su análisis por electroforesis, con o sin la placa de carga, la matriz y el buffer, respectivamente según la modalidad elegida.
  • Se recomienda utilizar el kit MegaBACE DYEnamic ET Dye Terminator Kit (GE Healthcare), con eliminación de terminadores mediante precipitación con etanol o mediante el kit AutoSeq 96 Dye Terminator Clean-up (GE Healthcare).
  • El usuario entregará junto con las muestras, una hoja Excel (Envío Muestras Secuenciación) con el diseño de la placa, en el que se incluyan los nombres de las muestras y el orden en el que desea cargarlas.
• Secuenciación completa
  • El usuario entregará 20 µL de DNA plasmídico o producto de PCR cuantificado y resuspendido en agua estéril, junto con una foto del material y de un marcador de pesos moleculares en un gel de agarosa.
  • La concentración cuantificada mínima exigida es de 100 ng/µL para DNA plasmídico y de 50 ng/µL para producto de PCR.
  • El Servicio se encargará de realizar la reacción de secuenciación, la eliminación de terminadores y la electroforesis.
  • El éxito de la secuenciación está íntimamente relacionado con la calidad y pureza del DNA, pudiendo también influir la cepa bacteriana, el vector de clonación y la naturaleza del fragmento a secuenciar. Ante esto, el DNA plasmídico entregado deberá estar libre de RNA, proteínas y sales, y el producto de PCR deberá estar purificado para eliminar los cebadores y el exceso de desoxinucleótidos que interfieren en la reacción de secuenciación. Para su purificación se recomienda usar ExoSAP-IT(GE Healthcare).
  • El usuario rellenará una hoja Excel (Envío Muestras Secuenciación) donde indicará claramente el nombre de la muestra, el vector de clonación y el tamaño del inserto, o el tamaño del producto de PCR y el programa térmico utilizado para su amplificación, y nombre, secuencia y Tm de los cebadores a emplear.
  • El Servicio dispone de los siguientes cebadores:
    • M13 directo (-40):
    • 5’GTT TTC CCA GTC ACG ACG TTG TA 3’
    • M13 directo (-27):
    • 5’CGA CGT TGT AAA ACG ACG GCC AGT 3’
    • M13 directo (-21):
    • 5’TGT AAA ACG ACG GCC AGT 3’
    • M13 reverso (-29):
    • 5’CAG GAA ACA GCT ATG ACC 3’
    • M13 reverso (-27):
    • 5’GGA AAC AGC TAT GAC CAT 3’
    • Sp6:
    • 5’GAT TTA GGT GAC ACT ATA G 3’
    • BGH reverso:
    • 5’TAG AAG GCA CAG TCG AGG 3’
    • T7 directo:
    • 5’GAA ATT AAT ACG ACT CAC TAT 3’
    • T7 reverso:
    • 5’GCT AGT TAT TGC TCA GCG GTG 3’
  • Se puede utilizar cualquier otro cebador sintetizado por el usuario siempre que cumpla los siguientes requisitos:
    • Longitud: 16-22 nucleótidos
    • % GC: 40-50%
    • Tm: 50-65º C.
  • El usuario debe proporcionar un volumen mínimo de 10 µL del cebador de concentración 5 µM por reacción.

Con el Secuenciador Automático MegaBACE500(GE Healthcare) se pueden utilizar hasta 4 marcadores fluorescentes simultáneamente: FAM, TMR, HEX y ET-ROX, este último reservado para el marcador de tamaños moleculares, y combinar diferentes tamaños alélicos en la misma muestra, por lo que por cada capilar en una sola electroforesis se pueden analizar multitud de fragmentos.

Modalidades:

• Autoanálisis y autoanálisis sin material de carga
  • Dada la especificidad de la técnica, el Servicio se hará cargo únicamente de la etapa final, es decir, de la separación y análisis de los fragmentos mediante electroforesis.
  • En algunos casos puede ser necesario un paso de purificación de los fragmentos (ExoSAP-IT(GE Healthcare) o precipitación con etanol) antes del proceso de electroforesis.
  • Para la determinación de los tamaños el Servicio dispone del marcador de pesos moleculares “MegaBACE ET-400-R”, con un total de 20 fragmentos en un rango entre 60 y 400 pb y con emisión de fluorescencia a 610 nm (ET-ROX), si bien pueden usarse los marcadores de GE Healthcare “MegaBACE ET-550-R” y “MegaBACE ET-900-R”, o cualquier otro marcador de tamaño marcado con ET-ROX aportado por el usuario.
  • El usuario entregará junto con las muestras, una hoja Excel (Envio Muestras Genotipado) con el diseño de la placa en el que se incluyan los nombres de las muestras, el orden en el que desea cargarlas y la descripción de los distintos polimorfismos que se van a analizar.

El análisis de polimorfismos de un sólo nucleótido (SNPs) se basa en el uso de cebadores específicos que terminan justo antes de la base a determinar. Se realiza una reacción de PCR sólo con los 4 didesoxinucleótidos, marcados cada uno con un fluoróforo diferente. La detección de la base incorporada revela la presencia/ausencia de polimorfismo.

Con el Secuenciador Automático MegaBACE500 (GE Healthcare) se pueden analizar varios SNPs en el mismo capilar ya que el sistema permite la inyección consecutiva de varias reacciones, utilizando para ello un marcador de inyección.

Modalidades:

• Autoanálisis y autoanálisis sin material de carga
  • Se entregan las reacciones de SNuPe ya preparadas para su análisis por electroforesis, con o sin la placa de carga, la matriz y el buffer, respectivamente según la modalidad elegida.
  • Se recomienda utilizar el kit MegaBace SNuPe genotyping kit(GE Healthcare), con eliminación de terminadores mediante purificación con SAP(GE Healthcare).
  • El usuario entregará junto con las muestras, una hoja excel con el diseño de la placa en el que se incluyan los nombres de las muestras y el orden en el que desea cargarlas, el número de inyecciones que se van a realizar y la descripción de los distintos polimorfismos que se van a analizar.
• Análisis completo
  • El usuario entregará 10 µL de producto de PCR cuantificado y resuspendido en agua estéril, junto con su foto en un gel de agarosa.
  • La concentración cuantificada mínima exigida es 50 ng/µL.
  • El Servicio se encargará de realizar la reacción de SNuPe, la eliminación de terminadores y la electroforesis.
  • El producto de PCR deberá tener una longitud mínima de 350 pb y estar purificado para eliminar los cebadores y el exceso de desoxinucleótidos que interfieren en la reacción de SNuPe. Para su purificación se recomienda usar
  • ExoSAP-IT(GE Healthcare).
  • El usuario indicará claramente el nombre de la muestra, el tamaño del producto de PCR y el programa térmico utilizado para su amplificación.
  • El usuario debe de proporcionar un volumen mínimo de 5 µL de la sonda de concentración 2 µM por reacción, junto con el nombre, la secuencia y la Tm de la misma, además de la descripción completa del correspondiente polimorfismo.
  • Las sondas deben cumplir los siguientes requisitos:
    • Haber sido purificadas mediante HPLC.
    • Tener una longitud comprendida entre 18 y 25 nucleótidos.
    • Acabar justo antes del polimorfismo correspondiente.
    • No formar estructuras secundarias (las 3 últimas bases del extremo 3′ no deben ser complementarias a ninguna otra región del cebador).
    • Evitar el uso del desoxinucleótido G en posición 3′ terminal

Compuesta por los secuenciadores de sobremesa Ion PGM e Ion S5XL y los equipos de preparación de librerías y moldes Ion One Touch 2 y Ion Chef.

Está basada en secuenciación por síntesis (SBS, Sequencing by Synthesis), utilizando tecnología de semiconductores (medición de la liberación de protones durante la reacción de polimerización del ADN) sin intervención de detección óptica y utilizando química nativa, siendo el método de amplificación previo para la producción de grupos de matrices clónicos de molécula única PCR en emulsión.

Admite chips de distinta capacidad lo que permite flexibilizar la productividad trabajando en el mayor número de rangos posible para, así, optimizar la utilización y coste de fungibles.

Ofrece la máxima velocidad de carrera posible.

Integra amplificación, secuenciación y análisis de datos (identificación de bases, alineación, identificación básica de variantes y elaboración de informes), generando archivos estándar de salida con formatos compatibles con la mayoría de los software de terceros (fastq, bam, vcf, texto (csv, tsv).

Permite el abordaje de las siguientes aplicaciones:

• Resecuenciación del genoma completo
• Resecuenciación selectiva
• Secuenciación de novo de genoma pequeño (vírico o bacteriano)
• Secuenciación de ARNmensajero y ARNpequeño
• Secuenciación de Transcriptoma dirigido
• Secuenciación de Transcriptoma completo
• Secuenciación de Exoma
• Secuenciación de ADN modificado con bisulfito para estudios de perfiles de metilación
• Secuenciación ChIP-Seq para estudios de interacciones DNA-proteína y RNA-proteína
• Secuenciación CNV-Seq para medición de la variación del número de copia
• Metagenómica (secuenciación de ARNr 16S)

Ion PGM (Life Technologies)

• Admite los chips 314, 316 y 318.
• Ofrece las siguientes productividades:

Ion S5XL (Life Technologies)

• Admite los chips 520, 530 y 540.
• Ofrece las siguientes productividades:
  

  Chip	520	530	540
  Reads	5 M	15-20 M	60-80 M
  Output	1-2 GB	3-5 GB	10-15 GB

Ion One Touch 2 (Life Technologies): Unidad externa para la preparación automática del molde de secuenciación.

Ion Chef (Life Technologies): Equipo automatizado de preparación de librerías, preparación de molde y carga de muestras en el chip.

• Consta de un array de 24 capilares no recubiertos internamente.
• Detecta 6 fluoróforos simultáneamente mediante un láser de estado sólido con línea espectral de 505nm.
• Es capaz de realizar Secuenciación de ADN, Genotipado y Análisis de SNP’s, utilizando los programas Sequencing Analysis™ v5.4, Seq Scape v2.7, Variant Reporter™ v1.1 y GeneMapper™ v4.1 para llevar a cabo el procesamiento automático completo de los datos obtenidos.
• Los 24 capilares, de 50 micras de diámetro y 50 cm de longitud, se rellenan de forma automática con el mismo polímero (POP-7) tanto para secuenciación como para genotipado o análisis de SNP’s.
• El equipo dispone de un sistema de identificación por radio frecuencia (RFID) para el seguimiento de lotes, caducidades y consumos de los reactivos.

Sistema para analizar hasta 96 muestras simultáneamente mediante pirosecuenciación. Es adecuado para el análisis simultáneo de tres polimorfismos genéticos, análisis de metilación de DNA y secuencias cortas de DNA (hasta 80 pb)

Sistema integrado para realizar tanto análisis de PCR a tiempo real como análisis post-PCR a punto final. Como estrategias de marcaje utiliza sondas TaqMan o SYBR Green.

Detecta hasta 6 fluoróforos simultáneamente mediante el nuevo sistema OptiFlex™.

Permite el uso de bloques intercambiables: bloques estándar de 96 o 384 pocillos, bloque Fast-PCR de 96 pocillos, que reduce los tiempos de carrera de 2h a 35 min, y bloque para arrays de baja densidad de 384 pocillos. El bloque para arrays de baja densidad permite combinar la tecnología de Applied Biosystems con la nueva tecnología de tarjetas microfluídicas, que simplifican el análisis de cientos de dianas utilizando un formato de 384 pocillos sin necesidad de robótica.

El equipo AutoGenflex permite realizar la extracción de DNA genómica de forma automática a partir de grandes volúmenes de sangre (5ml). El sistema AutoGenFlex puede utilizarse además de para sangre total, para aislar DNA de muestras de tejido, células en cultivo y muestras de saliva. Se realizan 40 extracciones simultáneamente.

Termociclador en gradiente de 96 pocillos con intervalo de temperaturas entre 0 y 105ºC. Permite la optimización de reacciones de PCR en un solo experimento al generar un gradiente en el bloque, mediante el sistema de rampa dinámica, de hasta 25º C dentro del rango 40-99ºC.

• Sistema robotizado para preparación automática de pre-PCR, pre-QPCR y librerías.
• Consta de 4 canales de pipeteo independientes, de volúmenes desde 0,5 hasta 1000 microlitros.
• Permite trabajar en cualquier formato: placas de 96 o 384 y tubos.
• Tiene capacidad para 12 posiciones de placas.
• Permite llevar a cabo pipeteo sencillo, pipeteo múltiple, preparación de réplicas, alícuotas, diluciones seriadas, prediluciones, mezcla de líquidos en el contenedor de origen o en el contenedor de destino, etc.
• Contiene una base termostatizada, un agitador con calentamiento, varios bloques criostáticos y una pinza para el desplazamiento de tubos y placas a lo largo de la base de la plataforma, todos ellos elementos necesarios para llevar a cabo de forma automatizada la mayor parte de los protocolos seguidos en la preparación de librerías en las distintas aplicaciones de secuenciación masiva.

Equipo para la cuantificación de DNA, RNA y Proteína mediante sustancias fluorescentes específicas para cada molécula.

Equipo para la cuantificación de ácidos nucleicos con lámpara de Xenon sin cubeta. Se requiere entre 1 – 2 µl de muestra y por su amplio rango de cuantificación (2 – 3700ng/µl dsDNA) no es necesaria diluir la muestra.

Cubeta Electro-Fast System Standard y Electro-Fast System Wide para la electroforesis horizontal de ácidos nucleicos con capacidad para analizar 96 muestras de forma simultánea con la posibilidad de aumentar a 192. Los peines disponen de un diente adicional para el marcador y permiten cargar las muestras con pipeta multicanal.